打开全新“视”界：冷冻电镜成像技术首达原子分辨率

作者：Ewen Callaway

冷冻电子显微镜突破关键壁垒，将能以前所未有的细节揭示蛋白质的作用方式。

脱铁铁蛋白的冷冻电镜照片。来源：Paul Emsley/英国医学研究委员会分子生物学实验室

冷冻电子显微镜（cryo-EM）这一革命性的分子成像技术生成了迄今为止最清晰的图像，并且首次分辨出了蛋白质的单个原子。

研究人员利用冷冻电镜技术达到了原子分辨率，将以空前的精细度解析蛋白质的作用方式，这是其他成像技术（如X射线晶体学）无法轻易做到的。

科学家认为，两个实验室不久前发表的这一突破巩固了冷冻电镜作为绘制蛋白质3D形状主要工具的地位。最终，这些结构将帮助研究人员了解蛋白质在健康和疾病中的作用，从而开发出副作用更少、疗效更好的药物。

"这绝对是一个里程碑，毫无疑问。没有再需要突破的了。这是分辨率的最后一道障碍。"其中一项研究[1]的负责人、德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所的生物化学家和电子显微镜学家Holger Stark说。另一项研究[2]由Sjors Scheres 和Radu Aricescu领衔，他们是英国医学研究委员会分子生物学实验室（MRC-LMB）的结构生物学家。两项研究都于5月22日发布在bioRxiv预印本服务器上。

加拿大多伦多大学结构生物学家John Rubinstein补充道："真正的'原子分辨率'是绝对意义上的里程碑。"不过，由于存在其他困难，如蛋白质具有的柔性（flexibility），想要获得蛋白质的原子分辨率结构仍将是一项艰巨的任务。他说："这些预印本论文至少告诉我们，如果其他限制因素被攻克的话，我们能到什么样的高度。"

打破壁垒

冷冻电镜已有几十年的历史了，它的原理是向快速冷冻的样品发射电子并记录生成的图像从而确定其形状。探测回弹电子的技术以及图像分析软件的进步触发了一场始于2013年的“分辨率革命”，并让研究人员最终得到了最清晰的蛋白质结构——几乎与利用X射线晶体技术得到的结果一样好。X射线晶体技术的出现时间更早，主要根据蛋白质晶体被X射线轰击时形成的衍射图案推断蛋白质的结构。

后续的软硬件更新使得冷冻电镜的结构分辨率得到了更大的提升。但是科学家还是要依赖X射线晶体学才能获得原子分辨率的结构。问题是，研究人员可能要花几个月到几年的时间才能使蛋白质结晶，而且许多医学上重要的蛋白质不会形成可用的晶体；相比之下，冷冻电镜只需要把蛋白质置于纯化溶液中即可。

原子分辨率的图谱非常精确，能够清晰识别蛋白质中单个原子的位置，分辨率约为 1.2 埃（ångström，1.2 × 10^-10 m）。这些结构在有些方面尤其有用，比如理解酶是如何起作用的，以及如何利用这些认知去发现能阻断其活性的药物。

为了能让冷冻电镜达到原子分辨率，两个团队选择了一种储铁蛋白——脱铁铁蛋白（apoferritin）。这种蛋白具有岩石般的稳定性，也因此成为冷冻电镜的试验台：之前能达到的蛋白质结构分辨率为1.54埃[3]。

随后，团队利用技术上的提升拍摄到了脱铁铁蛋白更清晰的照片。Stark团队利用一种仪器得到了1.25埃的蛋白质结构，该仪器能确保电子在击中样品之前以相似的速度传输，从而提高了最终成像的分辨率。Scheres、Aricescu及其团队使用了另一种技术来发射电子，同样使电子以类似的速度运行；他们另外使用的一项技术还能减少某些电子从蛋白质样品中逃逸后产生的噪音，以及一个更灵敏的电子检测相机。Scheres说，他们获得的这个1.2埃的结构是如此完整，甚至可以从蛋白质和周围水分子中分辨出单个氢原子。

Stark认为，融合这些技术有望将分辨率提高到1埃左右，但这基本就到顶了。他说："对于冷冻电镜来说，低于1埃几乎是不可能实现的。"他的团队估计，利用现有的前沿技术获得这种结构需要"数百年的数据记录、不切实际的计算能力以及数据存储能力"。

一目了然

Scheres和Aricescu还在GABA_A受体这种蛋白质的简单形式上测试了他们的改进。这种蛋白质位于神经元的膜上，是全麻药物、焦虑药物和许多其他药物的靶标。去年，Aricescu团队利用冷冻电镜将这种蛋白质绘制到了2.5埃[4]。而利用新的工具，研究人员获得了1.7埃的分辨率，该蛋白质的某些关键部位的分辨率甚至更高。Aricescu说："就像是拨开你眼前的迷雾。在这个分辨率上，每半埃都能打开一个新天地。"

该结构揭示了蛋白质内从未见过的细节——包括一种名为组胺的化学物质所在袋内的水分子。Aricescu说："这对于基于结构的药物设计可谓是一个宝藏"，它展示了一种药物如何代替水分子，或能帮助发现副作用更少的药物。

Scheres说，获得GABA_A的原子分辨率图谱存在难度，因为它不像脱铁铁蛋白那么稳定。"也不是完全做不到，但是操作做起来非常不切实际。"因为你需要收集海量的数据。不过，其他方面的改进，特别是在蛋白质样本制备方式上的改进，或能为获得GABA_A和其他生物医学上重要的蛋白质的原子分辨率结构铺平道路。蛋白质溶液被冻结在微小的金制网格上，改变这些网格可以使蛋白质维持更加静止的状态[5]。

"所有人都对MRC-LMB和马克斯·普朗克团队所达到的惊人水平兴奋得溢于言表。”东京大学冷冻电镜专家Radostin Danev表示。但他也认为对于更不稳定的蛋白质来说，样品制备是该领域的主要挑战。他说："未来一段时间内，低于1.5埃甚至低于2埃的分辨率只能在一些表现良好的样本上实现。"

Scheres认为，这些突破可能会进一步巩固冷冻电镜作为大部分结构研究首选工具的地位。渴望解析原子分辨率结构的制药公司可能会更倾向于使用冷冻电镜了。但Stark认为X射线晶体学仍然会保持一定的吸引力。如果一种蛋白质可以结晶（不确定性很大），它就能在短时间内相对高效地产生能与数千种潜在药物结合的结构。但这仍需几小时到几天的时间，才能产生足够的数据生成超高分辨率的冷冻电镜结构。

Stark说："每种技术都有优缺点。大量的论文和综述都在说冷冻电镜的这些最新进展将是X射线的死亡信号。我不太相信这种说法。”

参考文献：

1. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A. & Stark, H. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.05.21.106740 (2020).

2. Nakane, T. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.05.22.110189 (2020).

3. Kato, T. et al. Microsc. Microanal. 25(S2), 998–999 (2019).

4. Uchański, T. et al. Preprint at bioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/812230v1 (2020).

5. Naydenova, K., Peet, M.J. & Russo, C. J. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 11718–11724 (2019).

原文以 ‘It opens up a whole new universe’: Revolutionary microscopy technique sees individual atoms for first time为标题发表在2020年6月3日的《自然》新闻版块

© nature

Nature|doi:10.1038/d41586-020-01658-1

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